亚群_亚群体

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单细胞ATAC亚群分析

上一期，跟大家简单介绍了 下单细胞ATAC的背景知识点及其10x ATAC基础数据的获取方式 。接下来就带大家从fragment.csv、singlecell.csv、peaks matrix等数据出发，做单细胞ATAC的亚群分析。

与单细胞转录组类似，单细胞ATAC的分析流程也主要包括细胞质控、peaks标准化及其降维分群、marker基因的鉴定等几个步骤。常用的单细胞ATAC分析流程软件包含 cell-ranger-atac、Signac和ArchR等。

单细胞ATAC的质控点一般包含以下几个方面：样本重复（biological replicates），bulkATAC vs scATAC的相关性、fragment length distribution、per nucleus read-depth、transcription start site (TSS) enrichment、双细胞比例等。

前面提到的样本相关性和fragments的长度分布主要是从整体水平上检查我们的单个样本数据的可靠性。

而要去掉不符合质控的细胞，我们主要从 fragments 数目 和 TSS enrichment score 这两点出发。

👉 fragments 数目：一般指单个细胞（barcode）所属的total fragments数目。这个不同的软件具体的定义不同，比如cell-ranger-atac和Signac指peaks所属区域的fragments 数目，其中singlecell.csv文件中peak_region_fragments列便是指fragments 数目，而ArchR是指全基因组所有的fragments 数（这个跟该软件的分析策略有关，后面会提到）。

备注：fragments 数目TSS enrichment score的阈值不仅与所用软件具体的计算公式有关（不同的软件具体的参数可能不同），也与自己数据的实际情况有关。比如哺乳动物和植物的单细胞ATAC数据TSS enrichment score就不能用相同的指标cutoff来衡量，一般来说哺乳动物的TSS enrichment score值要整体偏高些。

双细胞预测几乎是所有单细胞测序技术都得考虑的一个问题，从原理来说，我们每个barcode就是一个细胞，但是因为所有的实验技术都不是100%完美的，因此往往会有一个barcode所包裹的油滴进来2个细胞。

对于10x数据来说，即使在使用标准试剂盒时，也可能有超过5%的细胞属于双细胞，这对聚类产生了重大影响。特别是在发育/轨迹分析中十分受影响，因为doublets看起来像是两种细胞类型的混合物，这可能与中间细胞类型或细胞状态混淆。

为了预测哪些“细胞”实际上是双细胞的，ArchR会从我们真实的数据中随机模拟产生混合的“双细胞”数据，这些“双细胞”数据与我们所有细胞一起做降维并UMAP可视化（"双细胞"会投影到UMAP中，并识别它们邻近的细胞），在这个过程中，ArchR会计算每个细胞的Doublet Enrichment，值越大，表示该细胞是双细胞的可能性越大。

与单细胞RNA(scRNA-seq)相比，scATAC-seq数据由于其高维度和稀疏性而更具计算分析挑战性。主要体现在标准化和降维，这两大步骤跟单细胞转录组分析所用的统计学原理完全不同，以下为归纳总结的具体内容，如下表所示：

备注：TF-IDF LSI都是自然语言常用的统计学方法。

获得peak matrix后，跟基因类似，我们必须对其标准化。因为单细胞ATAC测的是DNA序列，对于二倍体物种来说，同一个位置最多有2套DNA序列，这便是单细胞ATAC peak matrix稀疏性的最大根源（单细胞转录组因测的是RNA，高表达的基因往往有多个转录分子）。因此，从数据实际情况出发，单细胞ATAC采取的是log(TF-IDF)( Term frequency-inverse document frequency) 标准化，简称文档频率法。

所有高维数据的分析都是采取降维的方式从多维到低纬的策略，之后还可以再次降维成2个维度并可视化（比如TSNE和UMAP）。我们对peaks是采取LSI降维的方式。

与单细胞转录组类似，降维后的单细胞ATAC数据也同样可以采取graph-based clustering的分群方法。Graph-based图聚类算法包括两步：首先用降维（PCA或者LSI）的数据构建一个细胞间的k近邻稀疏矩阵，即将一个细胞与其欧式距离上最近的k个细胞聚为一类，然后在此基础上用Louvain算法进行模块优化(Blondel, Guillaume, Lambiotte, Lefebvre, 2008)，旨在找到图中高度连接的模块。最后通过层次聚类将位于同一区域内没有差异表达基因(B-H adjusted p-value 低于0.05)的cluster进一步融合，重复该过程直到没有clusters可以合并。

备注：Signac和ArchR都是直接调用Seurat包的FindClusters()函数用不同分辨率来分群的。

细胞分群后，我们需要知道每个cluster属于什么细胞类型，也就是细胞命名。我们知道，单细胞转录组主要是依据每个cluster的marker基因来判断细胞类型的。那么 对于单细胞ATAC，是不是也可以定义出每个cluster的特异高表达的基因集呢？

答案是肯定的，一般来说，我们是通过基因body区域加上一定范围内的上下游区域的整体ATAC信号来计算每个细胞每个基因的genescore值。

1）Signac是通过 GeneActivity() 函数 来实现的，默认参数是基因上游2kb到TES区域。

2）而ArchR是通过 addGeneScoreMatrix() 函数 来实现的（createArrowFiles函数也会用默认参数得到genescore matrix矩阵），注意其计算原理稍微复杂，ArchR考虑到远端调控元件对基因活性的影响，因此默认的upstream和downstream范围更广。

在ArchR作者的发表文章中，他们测试了50多个不同的基因评分模型，并确定了一类在各种测试条件下表现始终优于其他模型的模型。这个模型类，在ArchR中作为默认实现，有三个主要组件:

marker 基因的ATAC信号（genescore值）同样可以在umap展示，也可以用小提琴图（VlnPlot），点状图（DotPlot）展示。与单细胞转录组相比，单细胞ATAC还多了基因区域的track的可视化展示。

单细胞ATAC的亚群分析介绍就到这里，下一篇会给大家介绍单细胞ATAC的高级分析内容，比如motifdeviation、 拟时间分析、 单细胞RNA与单细胞ATAC的整合分析等。

本分享更多是从知识点和分析原理来讲解和归纳总结，具体实现方法和流程脚本可以查看下面参考资料软件的官方文档，里面都写得都很详细清楚。

今天检查淋巴细胞亚群

淋巴细胞亚群分析正是检测免疫功能的重要指标

它能反映机体当前的免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等），对分析发病机制，观察疗效及检测预后都有重要意义

一、什么是淋巴细胞亚群？

人体的免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞等。T细胞主要参与细胞免疫，表达CD3抗原；B细胞主要参与体液免疫，表达CD19抗原；NK细胞表达CD16和/或CD56，在机体中不依赖抗原刺激自发地发挥细胞毒效应。其中，T细胞又包括辅助T细胞（Th）和抑制T细胞（Ts），它们分别表达CD4和CD8。

因此，我们可以通过检测细胞表面标记分子来分析不同淋巴细胞亚型的水平。例如，CD3代表总T细胞，CD3高表示总T细胞水平较高。CD4与CD8的比值通常大于1。CD4/CD8增高，表示辅助性T细胞高于抑制性T细胞，说明免疫力好。 CD4/CD8和CD3都高，就说明由于辅助性T细胞增高，所以总的T细胞也增高，是机体免疫力好的表现。那么这个值就越高越好吗？当然不是这么简单，接下来我们分别看看常见检测结果的临床意义。

二、淋巴细胞亚群是如何检测的？

细胞亚群的检测方法种类繁多，大多都是根据细胞表面抗原及其抗体的特异性反应设计的。随着单克隆抗体的问世及各种检测方法的建立，淋巴细胞亚群检测已经在临床上得到广泛应用。目前，流式细胞术（FCM）为淋巴细胞亚群检测的标准方法。流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是七十年代发展起来的高科学技术，集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，具有分析和分选细胞的功能。通过对细胞表面抗原的分析，流式细胞仪可以用于HLA-B27的检测（强直性脊柱炎）以及血液病/淋巴瘤的免疫分型

我们用于检测淋巴细胞亚群的流式细胞仪是美国BD公司的, 原理是利用不同单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，同时检测几种淋巴细胞的表面抗原，从而将不同功能的淋巴细胞区分开来，并且得到各亚群的相对比例。通过对不同亚群淋巴细胞相对计数、绝对计数以及比率的观察，可以监测感染性疾病 免疫性疾病 及 肿瘤 等疾病状态下机体的免疫状况，从而辅助诊断，判断病情变化。例如：CD4+T细胞膜外CD4分子具有人类免疫缺陷病毒（HIV）识别部位，HIV感染人体后，入侵CD4+T细胞，大量复制，导致CD4+T细胞破坏，数量剧减，功能受损，机体免疫机能严重缺陷，所以，CD4+T细胞检测是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）诊断及病情观察的重要指标。

三、淋巴细胞亚群检测的临床意义

正如上文介绍的，常规监测的淋巴细胞亚群包括T细胞（CD3+）、B细胞（CD3-CD19+）、NK细胞（CD3-CD16+CD56+）；其中T淋巴细胞的分类，主要是根据表面分化抗原将成熟T细胞分为CD4+、CD8-和CD4-、CD8+两大亚群，即上文提到的T辅助细胞和T抑制细胞。

通常情况下，T、B、NK三者百分比之和约为100%，在5%的偏差内为正常；CD4+%与CD8+%之和等于CD3+%，在5%的偏差内为正常。下面我们来看看临床上常见的改变有什么意义：1、CD3+细胞数的改变，表示T淋巴细胞总数在外周血MNC中的比例的变化。（1）下降常见于：某些白血病，应用免疫抑制剂，化疗或放疗过程中，长期接受放射性物质，先天性细胞免疫缺陷者，艾滋病，多发性骨髓瘤，传染性单核细胞增多症，某些病毒感染性疾病。（2）增高可见于：重症肌无力，某些自身免疫性疾病，慢性活动性肝炎、系统性红斑狼疮等。

2、CD4+/CD8+细胞比值改变：表明机体细胞免疫功能紊乱。不管是CD4+或CD8+细胞数发生变化均影响该比值。（1）CD4淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂患者。（2）CD8淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。（3）CD4/CD8gt;2.5表明细胞免疫功能处于ldquo;过度活跃rdquo;状态，容易出现自体免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。（4）CD4/CD8lt;1.4称为ldquo;免疫抑制rdquo;状态，常见于：A.免疫缺陷病，如艾滋病时的比值常显著小于0.5；B.恶性肿瘤；C.再生障碍性贫血、白血病；D.某些病毒感染。CD4/CD8降到1.0以下为ldquo;倒置rdquo;，是较为明显的异常。（5）若移植后CD4/CD8较移植前明显增加，则可能发生排斥反应。

3、NK细胞（CD3-CD16+和/或CD56+）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。

四、什么人该检测淋巴细胞亚群？

原则上来讲，在机体的免疫（防御、自稳、监视）功能受损的情况下要考虑检查淋巴细胞亚群，下面列出了一些常见情况：

（1）免疫防御功能受损（反复、严重、多重感染，常规治疗效果不佳）

（2）免疫自稳和耐受功能受损（过敏性疾病、自身免疫/炎症疾病表现）

（3）免疫监视功能受损（肿瘤性改变）

（4）其他特殊情况（血常规中淋巴细胞明显异常、家族免疫缺陷病史、长期使用免疫抑制剂）

近年来，新的细胞表面位点的发现、新单克隆抗体的问世、高新仪器的更新换代等都为淋巴细胞亚群检测的发展提供了可能性，进一步为临床诊断和治疗提供指导和帮助。希望大家也能多多了解和关注淋巴细胞亚群检测，为自己的免疫功能保驾护航。

根据功能特征可将tcell分为哪几个亚群，简述各亚群功能

T细胞是不均一亚群的细胞群体,根据其表面标志及功能特点,可分为不同亚群.根据TCR双肽亚群的构成不同,分为TCR-1

T细胞和TCR-2

T细胞;根据TCR-2

T细胞功能的特点可分为调节性T细胞,效应性T细胞和迟发型超敏反应T细胞;根据T细胞表面所表达的CD分子可分为TCR,CD3,CD2;根据CD4分子与CD8分子的表达与否,可分为CD2+,CD3+,CD4+,CD8-和CD2+,CD3+,CD4-,CD8+T细胞.

T细胞亚群的介绍

T细胞是一个不均一的细胞群体,分类方法有多种.按细胞表面分化抗原(CD)的不同,可分为CD4+和CD8+两大亚群;按T细胞表面受体(TCR)的不同,可分为αβT细胞γδT细胞;按功能可分为辅助性T细胞(Th 细胞)、抑制性T细胞(Ts细胞)、细胞毒T细胞(CTL或Tc细胞)和迟发型超敏反应T细胞(TDTH细胞);按对抗原应答的不同,分为初始T细胞(naive T cell)、活化的T细胞(activated T cell)和记忆性T细胞(memory T cell);以及区别于传统T细胞的NKT细胞等等

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